Gracias por visitar nature.com.Está utilizando una versión de navegador con soporte limitado para CSS.Para obtener la mejor experiencia, le recomendamos que utilice un navegador más actualizado (o desactive el modo de compatibilidad en Internet Explorer).Mientras tanto, para garantizar un soporte continuo, mostramos el sitio sin estilos ni JavaScript.Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 5907 (2022) Citar este artículoLa eficacia terapéutica de los virus oncolíticos (OV) administrados por vía intravenosa está limitada por el desarrollo de respuestas de anticuerpos neutralizantes contra el virus.Para eludir esta limitación y permitir la administración sistémica repetida de OV, aquí desarrollamos virus de ARN sintético que consisten en un genoma de ARN viral (ARNv) formulado dentro de nanopartículas lipídicas.Para dos candidatos a fármacos de virus de ARN sintético, el virus Seneca Valley (SVV) y el Coxsackievirus A21, demostramos la entrega y replicación de ARNv, el ensamblaje del virus, la propagación y la lisis de las células tumorales que conducen a una potente eficacia antitumoral, incluso en presencia de anticuerpos neutralizantes de OV en el torrente sanguíneo.La replicación de SVV sintético en tumores promueve la infiltración de células inmunitarias, la remodelación del microambiente tumoral y mejora la actividad del inhibidor del punto de control anti-PD-1.En ratones y primates no humanos, el SVV sintético se tolera bien y alcanza una exposición muy por encima del requisito de actividad antitumoral.En conjunto, la plataforma de virus de ARN sintético proporciona un enfoque que permite la administración intravenosa repetida de inmunoterapia viral.Los virus oncolíticos (OV) son una atractiva modalidad terapéutica contra el cáncer que mata selectivamente las células tumorales e inflama el microambiente tumoral (TME).La combinación de OV con inmunoterapias contra el cáncer tiene el potencial de promover la remodelación del TME y la activación de las células inmunitarias, lo que mejora el beneficio de los inhibidores del punto de control inmunitario (ICI) en tumores que responden mal o no.Hasta el momento, el beneficio terapéutico de la viroterapia oncolítica se ha limitado a la administración intratumoral que requiere una respuesta inmune antitumoral sistémica para ser eficaz contra las lesiones no inyectadas.Talimogene laherparepvec (Imlygic®)1 ha demostrado respuestas duraderas en pacientes con melanoma cuando se administra por vía intratumoral, al igual que el virus Coxsackie A21 (CAVATAK®)2.La administración intravenosa (IV) de OV puede mejorar la eficacia al exponer todos los sitios del tumor, incluidas las lesiones metastásicas pequeñas, a los OV.Sin embargo, es probable que el rápido desarrollo de anticuerpos neutralizantes contra el virus después de la administración IV limite la exposición y la infección de las células tumorales después de dosis repetidas3,4.Para maximizar el potencial de la inmunoterapia viral, se deben desarrollar estrategias para evitar la neutralización.La reorientación5,6, los portadores de células7,8, el recubrimiento con polímeros9,10,11 y los liposomas12,13 se han utilizado para proteger a los OV de los anticuerpos neutralizantes, pero ninguno ha llegado a la clínica.Los avances en nanotecnología y su uso para administrar ácidos nucleicos están allanando el camino para que los nuevos sistemas de transporte superen los desafíos de la administración IV de OV14,15.Aquí, describimos el desarrollo de una plataforma de administración basada en nanopartículas que permite la administración IV repetida de inmunoterapias virales.Las plantillas de plásmido están diseñadas y optimizadas para la transcripción in vitro (IVT) de genomas de virus de ARN (ARNv) que, tras la formulación en nanopartículas lipídicas (LNP), generan partículas con las propiedades biofísicas deseadas para respaldar la administración IV repetida.Como todos los componentes son sintéticos;denominamos a esta modalidad virus de ARN sintético.Para este estudio, seleccionamos dos picornavirus, Seneca Valley virus (SVV) y Coxsackievirus A21 (CVA21), con actividad oncolítica y seguridad clínica bien documentadas2,16,17,18,19.Sus genomas son ARN monocatenario de sentido positivo y son suficientes para iniciar el ciclo de vida viral después de ser introducidos en una célula tumoral permisiva.Este estudio informa sobre la entrega y replicación de vRNA de Synthetic-SVV y Synthetic-CVA21.Mostramos que los virus sintéticos son bien tolerados y demuestran la producción viral selectiva de tumores y la propagación en múltiples modelos de tumores, lo que resulta en oncólisis y eficacia antitumoral.Anticipamos que esta plataforma terapéutica abordará las limitaciones asociadas con la administración IV repetida y mejorará el potencial terapéutico de los OV.Para eludir los anticuerpos neutralizantes que inhiben la actividad de los OV administrados por vía intravenosa, desarrollamos virus de ARN sintético para la administración sistémica de ARNv a las células tumorales.Una vez que el ARNv/LNP se internaliza y se libera en el citoplasma de una célula tumoral, el ARNv se replica y genera una explosión de viriones infecciosos que se propagan localmente, destruyendo las células tumorales adyacentes y esto promueve el reclutamiento de células inmunitarias al TME (Fig. 1 ).Las construcciones de vRNA picornaviral SVV y CVA21 se validaron in vitro e in vivo por su capacidad para producir virus (Figs. 1 y 2 complementarias).Luego optimizamos una formulación de LNP para administración IV con las propiedades biofísicas deseadas: tamaño pequeño (85 nm), monodisperso y alta eficiencia de encapsulación (Fig. 3a complementaria).El virus de ARN sintético se compone de ARNv producido por IVT encapsulado dentro de un LNP.Dentro de las células tumorales, el ARNv recapitula todas las fases del ciclo de vida viral de modo que se replica y genera una explosión de viriones infecciosos que se propagan localmente, infectando y matando células tumorales, reclutando así células inmunitarias para el TME.Para garantizar que la replicación del ARNv se inicie después de la traducción de la poliproteína, los extremos del ARNv de IVT deben recapitular los del genoma viral de ARN.Estos términos se generan durante la IVT mediante una ribozima 5' optimizada y una plantilla de escorrentía producida por escisión por una enzima de restricción de tipo IIS en los extremos 3'.Para mejorar la potencia de Synthetic-SVV, introdujimos modificaciones en el sitio de entrada interno del ribosoma (IRES)20 y una mutación en VP2 que mejora la entrada viral21.Estas modificaciones mejoraron su eficacia en comparación con el SVV-001 vRNA22 (Figura complementaria 3b, c).Al final del estudio, se detectó la replicación de SVV en células tumorales y no en tejido hepático (Fig. 3d complementaria), lo que indica que la distribución sistémica de vRNA/LNP condujo a la replicación viral en células tumorales permisivas y no en tejidos sanos.La administración de SVV sintética resultó en una inhibición significativa del crecimiento tumoral (TGI) de xenoinjertos de cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) NCI-H446 (Fig. 2a), incluida la regresión de tumores muy grandes (> 500 mm3, Fig. 4a complementaria) sin cuerpo significativo pérdida de peso (Fig. 2b).La administración de Synthetic-SVV-Neg (un ARNv incompetente para la replicación) no inhibió el crecimiento tumoral (Fig. 2a), lo que demuestra que TGI está asociado con la replicación de SVV.Tres días después de la inyección IV de viriones de SVV sintético o SVV como control positivo, se detectó una señal robusta de hibridación in situ fluorescente (FISH) en el tumor a partir de las cadenas de ARN de sentido positivo y negativo (Figura complementaria 4b).La detección de ARN de cadena negativa, una plantilla para el genoma de ARN de cadena positiva de picornavirus, confirma inequívocamente la replicación del ARN viral.En tumores de ratones que recibieron dosis de Synthetic-SVV-Neg no replicante, solo se detectaron niveles bajos de ARN de cadena positiva, probablemente asociados con ARNv/LNP residual en los vasos sanguíneos (Fig. 4b complementaria).a-d Ratones desnudos atímicos implantados por vía subcutánea con tumores de xenoinjerto SCLC NCI-H446.a, b Los ratones se trataron mediante administración IV con control de vehículo (PBS), Synthetic-SVV-Neg o Synthetic-SVV los días 1, 8 y 15, a 1,0 mg/kg (n = 8 por grupo).Se controlaron el volumen del tumor (mm3) y los cambios en el peso corporal (%).Se controlaron el crecimiento tumoral (mm3) y los cambios de peso corporal (%).Los datos se presentan como media ± sem. La significación estadística se determinó mediante un modelo lineal mixto ***p < 0,001 frente a PBS y ^^^p < 0,001 frente a Synthetic-SVV-Neg.c, d Replicación de Synthetic-SVV en tumores NCI-H446 después de una única dosis IV de 0,1 mg/kg de SVV.c Los niveles de ARN de cadena negativa de SVV se determinaron mediante RT-qPCR (n = 5 por punto de tiempo).Las partículas de infección por SVV (PFU) se determinaron mediante un ensayo de placas.Se evaluaron n = 3 muestras de tumores independientes por punto de tiempo.d FISH específico para las cadenas de ARN positivas (rojas) y negativas (blancas) de SVV se muestran para las secciones del tumor NCI-H466.Los núcleos se marcaron con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI).Estas imágenes son representativas de cuatro muestras independientes.La escala del panel se indica debajo de la imagen.e, f Ratones desnudos atímicos (n = 7 por grupo) implantados por vía subcutánea con tumores de melanoma humano SK-MEL-28 fueron tratados mediante administración IV con control de vehículo (PBS) o Synthetic-CVA21 en los días 1 y 8 en 2 dosis diferentes, 0,2 mg/kg o 0,05 mg/kg.Se controlaron el crecimiento tumoral (mm3) y los cambios de peso corporal (%).Los datos se informan como media ± sem. La significación estadística se determinó mediante un modelo lineal mixto ***p < 0,001 frente a PBS.Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.Para explorar la relación dosis-respuesta después de la administración IV de Synthetic-SVV, realizamos una titulación de dosis.Se observó una TGI potente de tumores de xenoinjerto NCI-H466 en todos los niveles de dosis, con una TGI máxima alcanzada con 0,1 mg/kg o más (Fig. 4c complementaria).Por tanto, se seleccionó una dosis de 0,1 mg/kg para caracterizar la cinética de replicación viral.Después de una sola administración IV de Synthetic-SVV, los tumores se recolectaron en múltiples puntos de tiempo y se analizaron mediante RT-qPCR y FISH.El ARN viral de cadena negativa y los viriones intratumorales se detectaron a los 3 días y alcanzaron una meseta en la mayoría de los tumores a los 7 días posteriores al tratamiento.Sorprendentemente, se detectó una replicación sostenida de SVV hasta 21 días después de administrar una única dosis baja de Synthetic-SVV (Fig. 2c).Estos hallazgos se recapitularon en gran medida con la detección FISH de cadenas de ARN positivas y negativas de SVV, con la señal FISH ampliamente distribuida en el tumor y alcanzando su punto máximo el día 10 (Fig. 2d).CVA21 fue seleccionado como segundo candidato a virus de ARN sintético, en función de sus propiedades oncolíticas, tolerabilidad intravenosa favorable en pacientes con cáncer2,23,24 y tropismo tumoral distinto en comparación con SVV16,24.El ARNv transcrito de CVA21 IVT formulado con la misma composición de lípidos que se utilizó para el SVV sintético produjo nanopartículas con propiedades biofísicas igualmente deseables.Se observó regresión tumoral completa a niveles de dosis bajos en el modelo de melanoma SK-MEL-28 (Fig. 2e), sin pérdida significativa de peso corporal (Fig. 2f).La tolerabilidad del virus sintético-SVV se evaluó en ratones inmunocompetentes A/J tolerantes a la infección por SVV22.La administración intravenosa de Synthetic-SVV a 3 mg/kg fue bien tolerada cuando se administró a ratones A/J con tumores de neuroblastoma singénico, N1E-11525.No se observaron cambios adversos significativos en el peso corporal, signos clínicos o hallazgos histopatológicos (Fig. 5a complementaria).La cuantificación de OC por cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) mostró una amplia distribución de LNP en todos los tejidos analizados a los 30 minutos después de la dosis (Fig. 5b complementaria), seguida de una eliminación rápida como lo demuestra la falta de detección de OC a las 24 horas.No hubo cambios en la química clínica, incluida la función hepática (Figura complementaria 5c-e).Se observó una elevación transitoria de citoquinas proinflamatorias (Fig. 5f-j complementaria), como se informó para otros LNP administrados sistémicamente26, pero no estuvo acompañada de activación del complemento (Fig. 5k complementaria).En ratones A/J ingenuos, Synthetic-SVV mostró una replicación viral mínima y transitoria en pulmón, bazo e hígado (Fig. 5l complementaria).El CVA21 sintético también fue bien tolerado en un ratón transgénico que expresa el gen ICAM1 humano (huICAM1), el receptor celular para CVA21, y se sabe que es sensible a la infección por CVA2127,28.La administración IV de Synthetic-CVA21 no provocó ningún signo clínico adverso (Fig. 6a complementaria).Los hallazgos histopatológicos se limitaron a cambios microscópicos leves en el hígado, atribuidos principalmente al tratamiento con la formulación de LNP.Se detectaron niveles bajos de replicación de CVA21 por RT-qPCR y por ensayo de título de placa en el bazo, hígado, pulmón, corazón y riñón 2 días después de la dosificación.Sin embargo, el ARN de cadena negativa o los viriones CVA21 fueron indetectables a los 7 días (Fig. 6b, c complementarias), lo que indica que los ratones habían eliminado la infección por CVA21.Estos datos sugieren que Synthetic-SVV y -CVA21 son bien tolerados en modelos de ratones que se sabe que son permisivos con estos virus a niveles de dosis superiores a los necesarios para provocar la regresión del tumor.La tolerabilidad de Synthetic-SVV se evaluó adicionalmente en primates no humanos (NHP) dosificados tres veces cada dos semanas con 1 mg/kg de Synthetic-SVV.No se observaron signos clínicos, se observaron efectos significativos en los pesos corporales (Fig. 7a complementaria).El análisis farmacocinético del componente lipídico LNP indicó que la exposición (AUC0-∞) alcanzada en el plasma NHP fue 85 veces superior a la exposición lograda en ratones desnudos atímicos que recibieron la dosis máximamente eficaz en el modelo SCLC NCI-H446 (Figura complementaria 4a y Tabla 1).La administración sistémica de Synthetic-SVV distribuyó el ARNv a todos los tejidos examinados, incluidos el bazo, el hígado, los riñones, los músculos, los pulmones y el cerebro, 24 h después de la tercera dosis (Fig. 7b complementaria), lo que refleja la amplia biodistribución del lípido LNP. componente observado en ratones portadores de tumores (Fig. 5b complementaria).Además, no se observaron hallazgos histológicos en NHP.Solo se observó una elevación menor y transitoria de los parámetros químicos hepáticos (Fig. 7c-e complementaria).Las citocinas proinflamatorias plasmáticas, incluidas IL-6 y MCP-1 y la actividad del complemento, aumentaron transitoriamente dentro de las 2 a 24 h posteriores a la dosis intravenosa (Fig. 7f-h complementaria).Estos resultados demuestran la tolerabilidad de dosis repetidas de Synthetic-SVV en monos cynomolgus a un nivel de dosis que supera las exposiciones necesarias para provocar una potente actividad antitumoral.Postulamos que la entrega de vRNA/LNP sería resistente a los anticuerpos neutralizantes de virus en circulación.Para probar esta hipótesis, inmunizamos pasivamente ratones inmunodeficientes portadores de NCI-H466 con un suero de conejo de control o un suero anti-SVV de conejo con potencia de neutralización confirmada para SVV-001, SVV (S177A) y SVV (S177A-IRES2). ) virus, este último codificado por el vRNA en Synthetic-SVV (Figura complementaria 8a-c).Luego comparamos la eficacia antitumoral de 0,1 mg/kg de viriones de SVV sintético o SVV (S177A-IRES2) (Fig. 3).Los animales tratados con suero de control que recibieron una dosis de SVV (S177A-IRES2) o SVV sintético exhibieron una potente actividad antitumoral en relación con el control del vehículo.Por el contrario, en ratones pretratados con suero anti-SVV, la eficacia del SVV (S177A-IRES2) administrado por vía IV se anuló por completo, mientras que el Synthetic-SVV siguió siendo potente para inhibir el crecimiento de los xenoinjertos NCI-H466.Se observó una anulación similar de la actividad del SVV-001 clínicamente evaluado en presencia de anticuerpos neutralizantes, mientras que el Synthetic-SVV permaneció activo (Fig. 8d complementaria)La eficacia antitumoral del virus derivado de SVV sintético SVV (S177A-IRES2) y el SVV sintético según lo evaluado por el volumen del tumor (mm3) se evaluó en ratones portadores de tumores NCI-H446 después de la inyección de suero de conejo anti-SVV de control o neutralizante.Los ratones que se inmunizaron pasivamente con antisueros de SVV recibieron 3 inyecciones IV de 106 UFP de viriones de SVV (S177A-IRES2) o 0,1 mg/kg de SVV sintético (n = 10 por grupo).Los datos se presentan como valores medios +/− SEM.La significación estadística se determinó utilizando un modelo lineal mixto.p < 0,001 frente a PBS, SVV(S177A-IRES2) y Control Ab.Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.Luego buscamos evaluar la actividad de Synthetic-SVV en modelos que pueden ser más representativos de SCLC humano que los modelos de xenoinjerto subcutáneo.SCLC es una indicación apropiada para el desarrollo clínico de Synthetic-SVV, dado que SVV tiene un tropismo establecido para tumores de origen neuroendocrino16,22.En ratones con tumores NCI-H82 implementados ortotópicamente en el pulmón, dos administraciones IV de Synthetic-SVV desencadenaron la replicación de SVV (Figura complementaria 9a) y casi duplicaron la supervivencia frente a los brazos de control (Figura 4a).Se utilizó inmunohistoquímica (IHC) para el ligando 3 similar a Delta humano (hDLL3), un marcador neuroendocrino altamente expresado en células NCI-H82 (Fig. 9b complementaria), para cuantificar la carga tumoral.La evaluación de los tejidos recolectados 10 días después del tratamiento reveló una reducción significativa de la carga tumoral y una extensa necrosis tumoral central en el pulmón de los ratones tratados con Synthetic-SVV (Fig. 4b, c).Los tumores a–c NCI-H82 se implantaron ortotópicamente en ratones desnudos atímicos.Los animales recibieron dosis de PBS, 1,0 mg/kg de SVV sintético-Neg o 1,0 mg/kg de SVV sintético los días 15 y 22 después de la inoculación del tumor (n = 15 por grupo).a El análisis de supervivencia se evaluó mediante la prueba de rango logarítmico (Mantel-Cox), ***p = 0,003;****p < 0,0001 frente a SVV sintética.b Análisis morfométrico del área positiva de hDLL3 de tejido pulmonar y extrapulmonar ocupado por tumor viable en pulmones recogidos de ratones 10 días después del tratamiento.La significación estadística se determinó utilizando la prueba T pareada de dos colas, *p = 0,011;***p = 0,0003.c Imágenes representativas de la tinción de hDLL3 según lo determinado en 15 muestras individuales/brazo de tratamiento.Las barras de escala en la parte superior izquierda son 1000 µm.d A ratones NOD/SCID se les implantaron por vía subcutánea tumores SCLC PDX (Crown Bioscience, San Diego, CA) y se dosificaron mediante administración IV con control de vehículo (PBS), Synthetic-SVV-Neg o Synthetic-SVV 1 mg/kg los días 1 y 8 (n = 8 por grupo).El volumen del tumor (mm3) se controló en varios puntos de tiempo.Los ratones e RPM se implantaron por vía subcutánea con células de cultivo primario SCLC GEMM y se dosificaron por administración IV con control de vehículo (PBS), Synthetic-SVV-Neg o Synthetic-SVV 1 mg/kg los días 1 y 8 (n = 8 por grupo ).El volumen del tumor (mm3) se controló en varios puntos de tiempo.d, e Los datos se presentan como valores medios +/− SD.La significación estadística se determinó utilizando un modelo lineal mixto, ***p < 0,001 frente a PBS y ^^p < 0,01;^^^p < 0.001 vs. Sintético-SVV-Neg.Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.Se cree que el xenoinjerto derivado del paciente (PDX) y los modelos de ratón modificados genéticamente (GEMM) representan mejor la heterogeneidad y la alteración genética de los cánceres humanos29.Dado que SCLC es conocido por su heterogeneidad que conduce a la aparición de enfermedad resistente al tratamiento y recurrencia30,31,32, evaluamos la capacidad de Synthetic-SVV para replicarse en un modelo SCLC PDX.A los ratones que portaban un modelo SCLC-PDX se les dosificó IV con Synthetic-SVV, Synthetic-SVV-Neg o vehículo e intratumoralmente con viriones SVV-001 como control positivo.Se observaron niveles similares de replicación viral cuando el Synthetic-SVV se administró sistémicamente, o los viriones SVV-001 se dosificaron intratumoralmente (Fig. 9c complementaria).Además, se observó una potente actividad antitumoral después de la administración de Synthetic-SVV (Fig. 4d).Los tumores que surgen de los GEMM imitan de cerca las características moleculares, la heterogeneidad del tumor y la histopatología de sus contrapartes humanas.Evaluamos la eficacia de Synthetic-SVV en un modelo GEMM de SCLC trasplantable33 (Rb1fl/flTrp53 fl/flMyc LSL/LSL) con perfiles histopatológicos y transcripcionales similares al SCLC humano.El SVV sintético inhibió significativamente el crecimiento tumoral (Fig. 4e).Los tumores recolectados 5 días después de la dosificación demostraron un alto nivel de replicación de SVV (Fig. 9d complementaria).Además, perfilamos los cambios en el microambiente inmunitario en este modelo mediante el panel Nanostring PanCancer IO 360™.Observamos un aumento notable de las puntuaciones asociadas con la citotoxicidad, la señalización del interferón y las vías del compartimento linfoide en tumores de ratones tratados con Synthetic-SVV frente al control del vehículo (Fig. 9e complementaria), lo que indica que la replicación in situ de SVV condujo a una TME más inflamada.El cambio en el TME provocado por Synthetic-SVV se caracterizó en el tumor singénico N1E-115, un modelo mal infiltrado por células inmunitarias (Fig. 10 complementaria).La administración de Synthetic-SVV condujo a un aumento significativo en el reclutamiento de células T CD8 y una tendencia para las células T CD4 y las células NK (Fig. 5a y Fig. 11a complementaria).El número de células T reguladoras (Treg) no aumentó en los tumores, lo que llevó a una proporción elevada de CD8/Treg que se ha asociado con un beneficio clínico mejorado con la terapia anti-PD-134 (Fig. 5b).Las células T CD8 mostraron un fenotipo activado, con CTLA4 y PD-1 regulados al alza (Fig. 5c).Tanto las células efectoras de vida corta (SLEC, CD8+, CD127, KLRG1+) como las células efectoras precursoras de la memoria (MPEC, CD8+, CD127+, KLRG1-) aumentaron con el Synthetic-SVV en comparación con el control (Fig. 5d).También se perfilaron los macrófagos asociados al tumor y se observó un aumento de la relación M1 (fagocítica, CD206-CD86+)/M2 (proinflamatoria, CD206+CD86−) (Fig. 5e y Fig. 11b complementaria).El número de macrófagos M1 (Fig. 5f) y células tumorales que expresan el ligando PD-1 (PD-L1) también aumentó significativamente (Fig. 5g).Se obtuvieron resultados concordantes cuando los tumores se analizaron con el panel NanoString PanCancer IO 360™ (Datos complementarios 1).El tratamiento con SVV sintético aumentó significativamente las vías asociadas con el reclutamiento y la activación de células inmunitarias (Fig. 12 complementaria).Estos datos indican que el Synthetic-SVV promueve el reclutamiento de células inmunitarias y la inmunidad antitumoral.Además, dos dosis semanales de Synthetic-SVV condujeron a una TGI significativa (Fig. 13 complementaria).Ratones a-g A/J (n = 5 por grupo) implantados por vía subcutánea con tumores neuroendocrinos N1E-115 singénicos.Los ratones se trataron mediante administración IV con control de vehículo PBS o 1 mg/kg de SVV sintético los días 1 y 8. Los tumores se recogieron 6 días después de la segunda dosis.a Número de células NK, NKT, CD4, CD8 y Treg por mg de tumor.Para CD8 p = 0,0002 con una prueba de ANOVA de dos vías b relación CD8/Treg.c Número de células T CD8 por mg de tumor que expresan CTLA-4 o PD-1.Para PD1 p = 0,01 con una prueba ANOVA de dos vías.d Número de células T CD8 por mg de tumor que son SLEC (CD127-KLRG1+) o MPEC (CD127+-KLRG1−).e Relación de macrófagos M1/M2.p = 0,0002 con una prueba T de Student pareada de dos colas.f Número de macrófagos M1 y M2 PD-L1+ por mg de tumor.p = 0,01 con una prueba T de Student pareada de dos colas.g Número de células CD45-PD-L1+ por mg de tumor.p = 0,01 con una prueba T de Student pareada de dos colas.Se implantaron tumores N1E-115 por vía subcutánea en ratones h A/J (n = 10 por grupo) y se trataron mediante administración IV con Synthetic-SVV los días 1 y 8 (0,3 mg/kg), y anticuerpo de control de administración IP (ratón IgG2a ) o anticuerpo anti-PD-1 en los días 1, 4 y 7 (200 µg) como se indica.Se controló el volumen tumoral (mm3).Los datos se informan como media ± sem. La significación estadística se determinó utilizando un modelo lineal mixto, *p = 0,01vs.IgG2a, *p = 0,03 frente a SVV sintético/IgG2a.h Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.El aumento de la inflamación en el TME y la regulación positiva de PD-L1 en las células tumorales N1E-115 y los macrófagos asociados a tumores proporcionaron una sólida justificación para combinar Synthetic-SVV con un antagonista de PD-1.Sorprendentemente para este modelo de tumor frío, el anticuerpo anti-PD-1 produjo un TGI modesto pero significativo, similar a una dosis subóptima de Synthetic-SVV;sin embargo, su combinación proporcionó una eficacia significativamente superior a la de cada agente individual (Fig. 5h).Este informe describe el diseño y desarrollo de virus de ARN sintético para el tratamiento sistémico del cáncer.La administración intravenosa de los genomas de ARNv para dos picornavirus, SVV y CVA21, formulados en LNP, se toleró bien y provocó la producción in situ específica de tumores de OV, el reclutamiento de células inmunitarias y, en última instancia, la destrucción del tumor.Se observó eficacia en múltiples modelos de cáncer, incluidos xenoinjertos, PDX, GEMM y modelos singénicos.Además, se observó un beneficio de supervivencia en un modelo de tumor SCLC ortotópico.El SVV sintético siguió siendo eficaz incluso en presencia de anticuerpos neutralizantes específicos del virus circulantes y se potenció aún más mediante la combinación con un inhibidor del punto de control inmunitario PD-1.Los OV en etapa clínica, incluidos aquellos con poca o ninguna exposición previa en humanos, como SVV, CVA21 o enadenotucirev, un adenovirus que no se produce de forma natural, han informado neutralización después de dosis IV repetidas, lo que probablemente limita la ventana de efectividad a un período de tiempo corto16, 17,23,35,36.Mostramos aquí que, en contraste con la actividad in vivo de los viriones de SVV, la actividad de Synthetic-SVV se mantuvo potente incluso en presencia de anticuerpos neutralizantes de SVV.Si bien ambos tratamientos utilizan el mismo genoma viral, es importante reconocer que la modalidad de virus sintético difiere significativamente de su padre picornaviral con respecto a la estabilidad, la biodistribución, el escape endosomal y el tropismo de entrada inicial;y, sin embargo, la dosis de Synthetic-SVV administrada al tumor fue todavía suficiente para provocar una fuerte eficacia antitumoral en presencia de antisueros neutralizantes.Presumimos que una vez que se entrega el genoma viral y se inicia la replicación en las células tumorales permisivas, la concentración de anticuerpos en el medio tumoral intersticial no alcanza el umbral requerido para inhibir la propagación de célula a célula durante la infección viral.Estos datos están en consonancia con la falta de impacto de la preinmunización sobre la actividad preclínica y clínica del VHS oncolítico después de la inyección intratumoral1,37.Por lo tanto, se prevé que nuestra estrategia supere el desafío central en el campo de los OV al permitir la administración IV repetida, brindando así una oportunidad para que todas las lesiones tumorales dentro de un paciente estén expuestas al agente terapéutico mientras evaden la neutralización.Por último, esperamos que la administración sistémica de virus de ARN sintético beneficie a los pacientes con enfermedad diseminada y a los pacientes para los que es difícil realizar inyecciones de OV intralesionales seguras repetidas.El tratamiento del cáncer de pulmón es particularmente interesante en este sentido ya que los dos virus de ARN sintético que describimos aquí, SVV y CVA21, tienen tropismo por SCLC y NSCLC, respectivamente.SVV tiene un tropismo conocido por SCLC17,22, y esto se confirma con nuestros datos que muestran actividad antitumoral en múltiples modelos de SCLC.El tropismo tumoral CVA21 está impulsado por la expresión de su receptor de entrada ICAM1, que se expresa en gran medida en NSCLC y otras indicaciones tumorales38,39.Además de su receptor de entrada, el tropismo viral también está limitado después de la entrada por IFN tipo I y factores de restricción virales dentro de la célula infectada.Estos son esenciales para considerar en el contexto de la plataforma de entrega de virus de ARN sintético, ya que utiliza LNP para eludir inicialmente el receptor de entrada viral.Si bien la administración IV del virus de ARN sintético condujo a una amplia distribución tisular, se observó una detección mínima y transitoria de la replicación de SVV o CVA21 en tejidos normales de cepas de ratones sensibles.Estos resultados demuestran la replicación y eliminación selectiva del tumor por la respuesta antiviral del huésped en tejidos normales.En general, los virus de ARN sintético fueron bien tolerados después de una o varias dosis intravenosas en ratones y primates no humanos, al igual que las formulaciones de ARNm/LNP que codifican las proteínas terapéuticas descritas por otros en estudios preclínicos40 y clínicos41.El modo de acción de los OV implica la destrucción directa de las células cancerosas y la estimulación de la inmunidad antitumoral42.El tratamiento de SCLC y NSCLC podría beneficiarse particularmente de la administración IV repetida de OV como lo permite la plataforma de virus de ARN sintético, ya que las inyecciones intralesionales seguras son un desafío en el cáncer de pulmón.SCLC y NSCLC son conocidos por una alta carga tumoral mutacional43,44, por su sensibilidad a los inhibidores de puntos de control inmunitarios y por ser capaces de replicar SVV y CVA21, respectivamente.Si bien la potente actividad antitumoral del virus de ARN sintético en modelos de tumores humanos xenoinjertados en ratones inmunocomprometidos probablemente se deba a la propagación desenfrenada de la infección dentro del tumor y la oncolisis, es probable que la infección esté limitada por las células inmunitarias que reconocen y eliminan las células infectadas en un huésped inmunocompetente.La detección inmunitaria de la replicación viral puede, a su vez, facilitar la eficacia de los virus de ARN sintético al mejorar el reclutamiento y la activación de las células inmunitarias.Como se observó para otros OVs37, Synthetic-SVV remodeló el TME y aumentó el número de células T CD8 y macrófagos fagocíticos M1.La regulación positiva de PD-L1 en células tumorales y mieloides proporcionó la justificación para combinar Synthetic-SVV con anti-PD-1, demostrando un beneficio terapéutico mejorado por encima de cada monoterapia.El beneficio de los antagonistas de PD-(L)1 actualmente aprobados para el tratamiento de SCLC y NSCLC se limita a un pequeño porcentaje de pacientes;nuestros datos sugieren que combinarlos con virus de ARN sintético puede mejorar los resultados en estos pacientes.Los virus de ARN sintéticos representan una modalidad terapéutica para el tratamiento del cáncer con el potencial de transformar el paradigma actual de inyección intralesional para VO en una conveniente administración IV repetida.Esta modalidad tiene el potencial de exponer todas las lesiones tumorales dentro de un paciente a un fármaco vivo potentemente oncolítico que puede infectar y propagarse en los tumores mientras estimula las respuestas inmunitarias antitumorales.Synthetic-SVV y Synthetic-CVA21 tienen una potente actividad en modelos preclínicos, incluso en presencia de anticuerpos neutralizantes, y son bien tolerados en roedores y primates no humanos.Estos datos respaldan la progresión de Synthetic-SVV y -CVA21 a ensayos clínicos para el tratamiento del cáncer de pulmón y otras indicaciones tumorales permisivas como monoterapia o en combinación con un régimen de atención estándar que contiene ICI.Todos los procedimientos experimentales en modelos animales, incluidos ratones y primates no humanos, fueron revisados ​​y aprobados por los respectivos Comités institucionales de cuidado y uso de animales, y siguieron las pautas de los NIH, tal como se especifica en la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio, 8.ª edición.Los estudios de NHP se realizaron en una instalación acreditada por la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC).Las RT-qPCR se recolectaron utilizando el sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 6 Pro de ThermoFisher (Applied Biosystems).Las secciones de inmunohistoquímica (IHC) se escanearon digitalmente con Hamamatsu Nanozoomer, el citómetro de imágenes Spectra Max i3X minimax se utilizó para cuantificar la fluorescencia y la caracterización de nanopartículas lipídicas (LNP) se realizó con Zetasizer Nano ZS, BO LSRFortessa con el software BO FACSDiva v8.0.3.Para los ensayos de inmunofluorescencia (IF), las imágenes se adquirieron en el escáner 30 Histec Panoramic 250.Para NanoString, las muestras se analizaron con el analizador digital nCounter.La concentración de lípidos de OC se determinó mediante análisis LC-MS.Para el paso cromatográfico se utilizó un sistema Waters Zevo TQs equipado con un detector MRM.Se utilizaron Microsoft Excel (Office 365), Graphpad Prism v9, FlowJo vl0.7.1 y 30 Histec Caseviewer 2.4 (CaseViewer-3DHISTECH Ltd.) para analizar los portaobjetos FISH.QuPath se utilizó para evaluar DLL3 IHC.La recolección de datos se llevó a cabo en el analizador digital nCounter (NanoString Technologies).Líneas celulares NCI-H466 (HTB-171), NCI-H82 (HTB-175), NCI-H1299 (CRL-5803), SK-MEL-28 (HTB-72), CT26 (RL-2638), 4T1 (CRL -2539) y N1E-115 (CRL-2263) se compraron todos de ATCC (Gaithersburg, MD).CT-2A-luc (SCC195) y MCC14/2 (10092303) se adquirieron de Millipore Sigma (Burlington, MA).La línea celular de adenocarcinoma de colon murino MC38 fue amablemente donada por el Prof. Joseph Glorioso de la Universidad de Pittsburgh.Los cultivos de células NCI-H446, NCI-H82, NCI-H1299, SK-MEL-28, MCC14/2, CT26 y 4T1 se mantuvieron en medio RPMI-1640 (Gibco, Gaithersburg, MD) complementado con 10 % de FBS (Gibco, Gaithersburg, MD) y penicilina/estreptomicina al 1% (Gibco, Gaithersburg, MD).Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.Los datos de origen se proporcionan con este documento.J. 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